已开展外泌体测序的植物信息汇总（部分）

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近年来植物外泌体研究备受关注，在植物外泌体的组学研究中，miRNA的研究热度居高不下。本公司自开展植物外泌体的miRNA测序服务以来，已处理植物种类超过100种，在此过程中也积累了大量经验，可总结以下几个方面：

1. 上清的制备方法：

植物外泌体通常从植物的汁液、培养上清液或组织酶解液中收集。在处理植物组织时，建议避免使用高剪切力的方法（如家用破壁机、中药粉碎机等），因为这些方法可能导致细胞破碎，降低外泌体的纯度。相反，建议采用温和的处理方式：a.易出汁植物：将植物切块后，通过纱布轻柔挤压榨取汁液，然后从汁液中分离外泌体；b.难出汁植物：将植物切成1毫米见方小块，使用植物果胶酶、纤维酶等消化液处理，去除组织碎片后，从上清液中分离外泌体；组织培养法：将植物组织或细胞置于适宜的培养基中培养，随后从培养上清液中分离外泌体；密实组织处理：对于根部或树干等组织，采用液氮冷冻后研磨的方式进行处理，以提高外泌体的分离效率。

2. 外泌体的分离方法：

在植物外泌体分离过程中，由于样本来源多样性及上清制备方法的差异性，所获物料的理化性质可能存在显著异质性。例如，部分植物样本含有高丰度的多糖多酚成分，部分样本汁液粘稠度异常偏高，或存在大量纤维性残留物等复杂基质干扰。常规商业化试剂盒常因标准化操作流程的限制，难以实现此类复杂样本的标准化处理效果。本实验室一般推荐采用超速离心技术为核心分离策略，在实验操作过程中，操作人员可依据样本特性对处理方案进行动态优化：针对高粘稠度样本，可通过PBS梯度稀释结合多轮高速离心（如10,000×g重复离心）降低粘度干扰；对于含色素或纤维残留较多的样本，可引入预过滤（如透析膜）或密度梯度离心（如蔗糖/碘克沙醇密度梯度）进行纯化。相较于其他方法，超速离心在应对植物样本高度异质性方面展现出更高的处理兼容性和稳定性。

3. RNA提取及建库方案：

针对外泌体RNA含量低的特点，本实验室推荐采用微量RNA高效提取与建库标准化流程。RNA提取环节选用Qiagen miRNeasy Mini Kit（货号：217004），其核心组分QIAzol Lysis Reagent为苯酚-硫氰酸胍单相裂解体系，可快速裂解外泌体膜结构，高效抑制RNase活性，同时通过有机相分离精准去除蛋白质、基因组DNA及代谢物干扰，确保微量RNA的高得率与高纯度。提取产物经毛细管电泳检测，确保RNA片段分布符合预期后，方可进入建库流程。文库构建采用Qiagen QIAseq miRNA Library Kit（货号：331509），该试剂盒基于分子条形码（UMI）技术，可有效消除PCR偏好性对定量结果的影响，同时支持低至1 ng总RNA的建库需求，兼容性强，可满足绝大多数微量样本的高效文库制备。

4. 生信分析方案：

针对植物外泌体研究的特殊性，本实验室提供多层级生物信息学解决方案：对于非模式植物物种，需基于物种拉丁学名进行系统性文献检索及基因组数据库筛查（如NCBI、Phytozome、Ensembl Plants等），优先匹配已发表的参考基因组及标准化注释文件。若目标物种缺乏高质量参考基因组，本方案采用差异化分析策略：对于miRNA分析，可依托跨物种植物公共数据库（如miRBase、PmiREN）进行保守性序列比对，并通过同源预测模型实现功能注释；对于靶基因功能解析，非模式物种需基于目标物种的转录组数据或近缘物种基因组进行同源注释库构建，再结合miRNA-mRNA互作算法（如psRNATarget、TargetFinder）完成调控网络预测；针对mRNA组分，可结合高深度测序数据通过de novo组装技术重构转录本结构，并利用功能富集分析（GO、KEGG）挖掘生物学通路特征。

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服务项目

服务序号	服务内容	服务说明	收费标准	服务周期
1	核酸提取（RNA）	采用微量RNA提取试剂盒进行RNA提取，并使用荧光仪进行RNA定量	150元/样	2个工作日
2	核酸质控（毛细管电泳）	采用毛细管电泳Qsep100进行外泌体核酸的片段分布质控	50元/样	2个工作日
3	转录组（miRNA）	采用Qiaseq进行miRNA建库测序及标准分析，illumina测序平台，下机数据量10M reads（3G RAW）	1000元/样	20个工作日
4	转录组（LncRNA）	采用Smartseq进行LncRNA建库测序及LncRNA和mRNA标准分析，illumina测序平台，下机数据量10G RAW	1000元/样	20个工作日
5	定制分析（De Novo）	采用De Novo基因组从头组装的方式来进行mRNA的分析，适合于没有参考基因组的物种	4000元/样	14个工作日
6	定制分析（靶基因功能）	模式生物（人、大小鼠等）默认包含靶基因功能分析，非模式生物（植物、微生物等）靶基因功能需先进行靶向物种的的参考基因组和注释构建方可完成靶基因功能的二次分析	1000元/样	7个工作日